Preimplantacijska diagnoza (PGD) diagnoza dednih bolezni in zarodkov

Genetsko testiranje je metoda, ki se uporablja za diagnosticiranje dednih okvar pri zarodkih, pridobljenih z in vitro oploditvijo pred nosečnostjo. Predimplantacijska diagnostika (PGD) je alternativa amniocentezi in biopsiji horionskih vilic, ki ji pogosto sledi težka odločitev o prekinitvi nosečnosti, če so rezultati neugodni.. Danes je PGD edina možnost, da se izognemo visokemu tveganju za otroka z genetskimi boleznimi..

 V katerih primerih se PGD izvaja v primeru genetskih bolezni

• Indikacije za diagnozo pred implantacijo po genetiki:
• Prenašalec avtosomno recesivnih bolezni;
• Patologija povezana s kromosomom X;
• Pari s pomembnimi kromosomskimi translokacijami, ki vplivajo na implantacijo, povzročajo spontane splave ali pa pomenijo duševne ali fizične težave pri potomcih;
• Prenašalec avtosomno prevladujočih bolezni.

Diagnoza pred implantacijo se uporablja za patologijo, povezano s spolom, okvaro posameznih genov in kromosomske motnje..

Zlorabe, povezane s spolom

X-povezane bolezni se prenesejo na otroka prek matere, ki je nosilec. Patološki X kromosom povzroča bolezni pri sinovih, ki ne dedujejo normalnega X kromosoma od svojega očeta, ampak dobijo Y kromosom. V prihodnosti se pričakuje rojstvo zdravih fantov, vendar je verjetnost prevoza za hčerko 50%, če je materina zdravje.

Je pomembno

Bolezni, povezane z X kromosomom, se nikoli ne prenašajo z očeta na sina.

Avtosomna recesivna patologija vključuje hemofilijo, večino nevromišičnih distrofij in več sto drugih bolezni..

Avtosomno dominantne motnje se bodo manifestirale kot Rettov sindrom, psevdo-hiperparatiroidizem, rahitis, odporen na vitamin D, Bloch-Sulzbergerjev sindrom (dedna motnja pigmentacije kože s patologijo vidnega aparata, zob in centralnega živčnega sistema) itd..

Kromosom Y nosi neznatno število genov, vendar so z njo povezane nekatere patologije spolne diferenciacije..

Pri hudih oblikah oslabljene spermatogeneze (kritično majhno število ali popolna odsotnost moških zarodnih celic) v 18% primerov se diagnosticirajo mikrodelecije v genu faktorja azoospermije, ki se nahaja na dolgi roki U kromosoma.

Okvare posameznega gena

PGD ​​se uporablja za identifikacijo posameznih defektov gena, ki povzročajo številne bolezni:

• Cistična fibroza;
• Bolezen tajskega Sachsa;
• Anemija srpastih celic;
• Huntingtonovo bolezen.

S temi patologijami genetska diagnoza zazna napako z uporabo molekularnih metod z uporabo pomnoževanja polimerazne verižne reakcije (PCR) (večkratna replikacija) DNA iz ene same celice.

Kromosomske motnje

Translokacija, inverzija in delecija povzročijo poškodbo kromosoma, ki se lahko odkrije s fluorescentno hibridizacijo. Pri nekaterih parovih je možnost zanemarljive nosečnosti brez PGD zanemarljiva, saj so prejšnji poskusi povzročili nastanek zarodkov s kromosomsko mutacijo in se končali s spontanimi splavi..

Predimplantacijski genetski pregled: relativne indikacije

Po raziskavah je večina zgodnjih splavov zaradi nosečnosti posledica aneuploidije, ki je kršitev števila kromosomov. Ker se zdrave zarodke prenesejo v maternico, se verjetnost spontanega splava v prvem in drugem trimesečju zmanjša..

Trenutno ni posebnega seznama indikacij za PGD.

Predimplantacijski genetski pregled je zaželen v naslednjih primerih:

• Načrtovana nosečnost pri starejši ženski.
• Obremenjena porodniška in ginekološka zgodovina s ponavljajočimi se spontanimi splavi.
• Neuspešni večkratni poskusi IVF, vključno z metodo ICSI.
• Močan moški dejavnik neplodnosti.

Dokazano dejstvo, da se tveganje za aneuploidijo povečuje s starostjo. Kromosomov je manj verjetno, da se pravilno razdelijo, kar povzroči dodaten ali odsoten kromosom v zarodku. Patološko število kromosomov je pri materah, starih od 35 do 39 let, več kot 20%, v starosti 40 let in več pa 40%..

Pogostost aneuploidije pri otrocih, starih od 35 do 39 let, se je rodila - 0,6-1,4%, starejši od 39 let - 1,6–10%.

Je pomembno

Vse nosečnosti se ne končajo z rojstvom otroka, ki je sposoben preživetja, včasih pride do samopreklopa, preden lahko ženska sumi na njeno stanje..

Primer pogoste aneuploidije je trisomija 21 kromosoma, ki vodi do Down sindroma. Pogostost trisomije 21 v plodu, sposobnem za preživetje, je bila ocenjena glede na starost matere. Glede na rezultate je optimalna starost za rojstvo otrok od 20 do 24 let (najnižja stopnja tveganja je 1/1400). Pri starosti 40 - 1/100, starejših od 45 let - 1/25.

Ponavljajoči se splavi in ​​PGD diagnoza

Če ima ženska 2 ali več zaporednih prekinitev nosečnosti do 20 tednov, je PGD upravičena pred IVF. Vzrok je pogosto neznan, kromosomske nepravilnosti pri zavrženih zarodkih pa so diagnosticirane v 50 do 80%..

Bodite pozorni

Študije so pokazale, da so pari z več spontanimi splavi izpostavljeni višjemu odstotku aneuploidnih zarodkov..

IVF večkrat zapored ni uspel

Tri ali več poskusov IVF, ki vključujejo zarodke visoke kakovosti, lahko kažejo na kromosomske nepravilnosti. Poleg tega se je treba spomniti na imunološke in maternične dejavnike, ki prispevajo k oslabljenemu vsaditvi..

Faktor moške neplodnosti

Moški hipogonadizem vodi do nastanka zarodkov s kromosomskimi nepravilnostmi. Pri normalnem semenu je prisotnih približno 3–8% obolelih semenčic. Njihovo število se pri moških s hudo neplodnostjo bistveno poveča (zmanjšanje količine, slaba morfologija in motnje motorične aktivnosti) na 27–74%.

Uporaba intracitoplazmatske injekcije sperme v jajčni celici, slaba kakovost sperme ni več ovira za zasnovo biološko avtohtonega otroka. Ugotovljeno je bilo, da so z moškim dejavnikom neplodnosti povezane različne genetske napake. Pogosteje so aneuploidija, Klinefelterjev sindrom, mikrodelecija Y kromosoma, poškodba androgenih receptorjev in druge avtosomne ​​genske mutacije (cistična fibroza)..

Je pomembno

Med postopkom ICSI se naravna selekcija izklopi, zato se poveča tveganje prenosa genetskih mutacij na potomce.

Izbira spola

PGD ​​lahko določi spol zarodka, vendar želja po rojstvu fanta ali dekleta brez dokazov (genetske bolezni, povezane s spolom) ni etična..

Skladnost s humanim antigenom levkocitov (HLA)

Med novimi indikacijami PGD je primerjava HLA. Ta metoda se lahko uporabi za izključitev genetske patologije. V primerih, ko ima družina že otroka z recesivno boleznijo in je potrebno zdravljenje s presaditvijo matičnih celic ali kostnega mozga (talasemija, levkemija), Možno je izbrati "primeren" zarodek, ki bo po rojstvu postal donor za proband (brat ali sestra).. Prvi primer je opisan z zgledom družine z otrokom, ki trpi zaradi anemije Fanconi, in PGD je bil izveden za izbiro zdravega zarodka z isto vrsto HLA kot bolni brat.. Uporaba PGD v takih situacijah je vprašljiva iz moralnih in etičnih razlogov..

Predimplantacijska diagnoza: kako se izvaja in kakšni so načini

Pare v coni tveganja se posvetuje z genetikom, ki oceni tveganje za prenos genske patologije. Opravite teste, ki potrjujejo diagnozo enega od staršev. Odvisno od genetske bolezni izberemo diagnostično metodo, s katero lahko ugotovimo spremembe v zarodku..

Za pridobitev biomateriala za PGD se uporablja samo IVF.. Na tretji ali peti dan po oploditvi se ekstrahira potrebni biomaterial. Genska analiza pred presaditvijo se izvede z uporabo verižne reakcije s polimerazo (PCR), fluorescentne hibridizacije (FISH), primerjalne genomske hibridizacije (CGH) in testiranja NGS..

Zdravi zarodki se prenesejo v maternico (praviloma ne več kot 2), preostali pa so vitrificirani. Hitro zamrzovanje vam omogoča uporabo v naslednjih ciklusih IVF.

PCR

PCR se uporablja za diagnosticiranje posameznih defektov gena, vključno z dominantnimi in recesivnimi motnjami.. PCR (včasih imenovan DNA amplification) je metoda, pri kateri se posamezno zaporedje kopira večkrat, kar omogoča analizo.

Za natančno diagnozo potrebujete kakovosten vzorec DNK, ki ga je težko pridobiti iz ene same celice..

Napake v analizi PCR lahko vodijo do prenosa slabe kakovosti zarodka pri 11% v avtosomno dominantno patologijo in pri 2% v recesivnih.

Polimerazna verižna reakcija vam omogoča, da določite diagnozo, če obstaja:

• Okvare posameznega gena pri avtosomski bolezni;
• Patologija posameznega gena pri moški neplodnosti;
• Identifikacija spola za X-povezane bolezni.

Fluorescentna hibridizacija (FISH)

FISH se uporablja za določanje spola pri X-povezanih boleznih, kromosomskih nenormalnostih in aneuploidnosti..

Sonde, ki predstavljajo majhne fragmente DNA, ki ustrezajo analiziranim kromosomom, se vežejo na "njihov" kromosom. Vsaka sonda ima lastno barvilo. Proces se vizualizira pod fluorescentnim mikroskopom. Število kromosomov vsake barve se šteje in pripravijo se sklepi..

Fluorescenčna in situ hibridizacija je upravičena, če je to potrebno za izvedbo:

• Aneuploidni presejalni testi pri ženskah, starejših od 38-39 let;
• Štetje števila kromosomov pri moški neplodnosti;
• Identifikacija spola pri boleznih, povezanih z X;
• Diagnoza starševskih prenosov, ki so privedli do ponavljajočih se večkratnih splavov.

Primerjalna genomska hibridizacija (CGH, SHG)

Človeška celica vsebuje 23 parov kromosomov; Vendar pa analiza FISH omogoča natančno oceno samo 7–9 kromosomov v vsaki pridobljeni celici. Zato številni nenormalni zarodki ostajajo neopaženi in se lahko uporabijo pri prenosu.

Ko izvajamo primerjalno genomsko hibridizacijo, testno DNA obdelamo s fluorescenčno barvo (zeleno) in rdečo za vzorec. Nato dve celici hibridizirata in primerja se razmerje med dvema barvama. Če analiza kromosomov pokaže presežek rdečega, zarodno jedro vsebuje dodaten kromosom. Če je presežek zelene barve, potem v jedru zarodka manjka eden od kromosomov.. SHS omogoča ne samo ovrednotenje vseh 23 kromosomov, temveč tudi podrobnejšo sliko dolžine, ki lahko zazna neravnovesje kromosomskih segmentov..

Ta metoda trenutno traja 72 ur. Glede na omejeno življenjsko dobo zarodkov v gojišču kulture je potrebna vitrifikacija zarodkov. Cryoprezervacija lahko povzroči 30% izgubo zarodkov, ki so sposobni preživetja, tudi ob visokem preživetju.. 

Bodite pozorni

V velikih reproduktivnih klinikah že delajo na pospešenih protokolih SHG, kjer rezultat postane znan po 24 urah, kar omogoča, da ne zamudite optimalnega časa za prenos..

Testiranje NGS

Metoda vključuje določitev zaporedja nukleotidov (osnovnih struktur dednega materiala) v RNA in DNA.

Koristi vključujejo:

• sposobnost ocenjevanja uporabnosti / pomanjkljivosti vseh kromosomov;
• zmanjšanje napak zaradi avtomatizacije procesov;
• hkratno dekodiranje več zaporedij;
• ponovljena analiza lokusa genetske kode;
• visoka občutljivost in natančnost;
• zmanjšanje zmotne ugotovitve (0,001%);
• atraumatski za zarodek;
• povečati možnosti za uspešno IVF.

Absolutne indikacije za NGS: prevoz kromosomskih nepravilnosti pri starših ali rodovih, genetske bolezni, povezane s spolom \ t.

Študija pred implantacijo NGS vključuje naslednje korake:

• biopsija zarodka v fazi blastociste, pogosteje biopsija trofektoderma;
• izolacija molekul nukleinskih kislin;
• ustvarjanje podlage za poznejše gensko testiranje,
• ojačanje za pridobitev amplikonov po metodi PCR, ki so vzeti kot vzorec;
• računalniška vizualizacija primarnega modela DNA / RNA kot rezultat večkratne neparalelne fragmentne analize.

Strokovnjak oceni računalniško grafiko, ki prikazuje patologijo v obliki padcev ali vrhov.

Na podlagi testiranja NGS se zavržejo zarodki z nizko vitalnostjo ali klinično izrazitimi mutacijami, preostanek po odmrzovanju pa v protokolih IVF.

Te analize ne izvajajo vse reproduktivne klinike..

Je pomembno

Diagnoza pred implantacijo ni vključena v seznam storitev za obvezno zdravstveno zavarovanje in jo plača bolnik.

Kaj se preiskuje z PGD

Večina klinik opravi biopsijo zarodkov na stopnji cepitve, vendar se lahko za PGD uporabi ena od treh metod..

Biopsija polarnega telesa

Metoda je primerna za odkrivanje genetske patologije pri ženskah, saj je ocenjeno število kromosomov v jajčni celici. Biopsija polarnega telesa ne omogoča pridobitve informacij o kromosomski strukturi prihodnjega zarodka, saj bo od druge prejela drugo polovico genskega materiala. Ta metoda se redko uporablja..

Biopsija zarodkov s hetchingom

Najpogostejša metoda PGD je študija posameznega blastomera, pridobljenega iz razvijajočega se zarodka tretjega dne. Jemanje blastomera je tehnično težaven postopek, ki ga izvajamo s posebnim mikroskopom in mikromanipulatorji. Cilj - odstranitev želenih celic z minimalno poškodbo zarodka.

Na tretji dan razvoja je zarodek sestavljen iz 6-10 celic, pred manipulacijo pa je v posebnem okolju 20 minut, da se zmanjša lepljenje blastomerov. Nato se zarodek fiksira in v notranjosti zone pellucida se ustvari luknja, ki odpira dostop do blastomerov. Ta postopek se imenuje "izvalitev" in se lahko izvaja z raztopino kisline, laserjem ali mehansko. V luknjo se vstavi pipeta, ki se osredotoča na izbrani blastomer z vidno jedro. Z aspiracijo se blastomer ekstrahira in obdeluje za FISH ali za PCR (PCR diagnoza), odvisno od genetske patologije. Zarodek se potopi v ustrezno gojišče..  

Slabosti metode so dejstvo, da je zarodek lahko mozaik, za genetsko analizo pa obstaja verjetnost odstranitve "zdravega" blastomera..

Biopsija blastociste

Nastanek blastociste se začne 5. dan in je določen z akumulacijo notranje in zunanje celične mase. Na tej stopnji je zarodek sestavljen iz približno 100 celic. Skozi luknjo se celice odvzamejo iz trofektoderma s pomočjo tanke pipete za biopsijo. Notranja celična masa ni poškodovana. Genetska analiza se izvaja z uporabo FISH ali PCR.

Omejitev diagnostičnega postopka - mozaik zarodka in potreben čas za študij - 24-48 ur, bistveno zmanjša sposobnost preživetja in moti implantacijo.

Edini izhod je zamrzovanje biomateriala, po katerem kakovost zarodkov trpi nekoliko.

PGD ​​se v večini primerov zaključi v 24 urah po opravljeni biopsiji, kar omogoča prenos na 4. ali 5. dan.

Bodite pozorni

Večina klinik analizira 24 kromosomov (22 avtosomov in 2 spolna kromosoma) s primerjalno genomsko hibridizacijo ob zarodku, ki doseže starost 5 dni..

Prednosti in slabosti genetske analize v 3-dnevnih in 5-dnevnih zarodkih

Tri dni:

• večje tveganje za poškodbe (približno 15%, pomembno vlogo, ki jo ima kvalifikacija embriologa);
• sposobnost izvajanja analize le 9 kromosomov, vključno s samo najpogostejšimi dednimi boleznimi;
• verjetnost biokemičnih in izpuščenih splavov zaradi patologije pri neraziskanih kromosomih;
• mozaicizem.

Pet dni:

• viabilnost zarodkov se zmanjša, ker obstajajo zunaj materinega telesa, je treba počakati, da se opravi biopsija (možno je, da se zgodnji blastocista izpostavi vitrifikaciji ali prenosu);
• ustavitev razvoja "dobrih" zarodkov, ki niso povezani z genetskimi dejavniki;
• možnost izvedbe celovite kromosomske analize;
• nizko tveganje za poškodbe zarodkov (približno 5%).

Je pomembno

Zarodki slabe kakovosti so zavrnjeni, če je prišlo do njihovega prenosa, nosečnost pa se ni pojavila ali se je končala z razvojem ali samo prekinitvijo v zgodnjih fazah.

Kaj je najboljši način za PGD

Strokovnjaki menijo, da je primerjalna genomska hibridizacija boljša kot

FISH-diagnostika, ker so možnosti metode širše, tveganje poškodb zarodka pa je manjše. S posebnostmi kariotipa staršev (npr. Translokacija) obstaja možnost, da se pridruži medkromosomski učinek - tveganje nepravilne divergence vseh kromosomov, ne le tistih, ki so poškodovani in diagnosticirani med karyotypingom pri materi ali očetu..

Slabosti vključujejo potrebo po krioprezervaciji in visokih stroških.

Študija FISH je bolj zaželena kot PCR, ker reakcija polimeraze nosi tveganje napačne diagnoze zaradi biološke kontaminacije..

Danes je najbolj učinkovita metoda - NGS - zaporedje nove generacije.

Mishina Victoria, urolog, zdravnik