Namen izvajanja molekularno genetskih raziskovalnih metod je določiti prisotnost modifikacij in sprememb nekaterih kromosomov, regij DNA ali genov. Ta metoda dela z DNK se je v praksi široko uporabljala v 70-ih in 80-ih letih. prejšnjega stoletja.
Kdaj pa molekularno genetske študije
Molekularne genetske študije pomagajo diagnosticirati:
- Monogene genetske bolezni;
- Verjetnost razvoja onkoloških bolezni;
- Prisotnost dejavnikov, ki povzročajo multifaktorske bolezni.
Ugotovitev tveganja za razvoj onkoloških procesov z uporabo molekularno genetskih raziskav:
- Tveganje za razvoj raka želodca in ščitnice;
- Verjetnost raka debelega črevesa in zgodnje faze te bolezni;
- Genetska predispozicija za razvoj raka telesa maternice, jajčnikov, mlečnih in prostatnih žlez;
- Prisotnost rekombinacije genov ABL / BCR, odkritih pri levkemiji;
- Prisotnost predpogojev, ki zagotavljajo učinkovitost protitumorskega zdravljenja z gefatinibom ob prisotnosti nedrobnoceličnega raka .
Izvedba molekularno genetskih testov za prisotnost genetsko določenih predpogojev za razvoj multifaktornih bolezni omogoča prepoznavanje tveganja za razvoj:
- hipertenzija;
- preeklampsija;
- revmatoidni artritis;
- osteoporoza;
- motnje metabolizma lipidov;
- diabetes mellitus tip 1 in 2;
- boleznijo reproduktivnega sistema.
S to metodo se oceni presnova in veljavnost uporabe nekaterih zdravil..
Kdo je predpisal molekularno genetske študije
Posameznikom so prikazani molekularni genetski testi:
- ki trpijo zaradi neplodnosti;
- izpostavljeni neugodnim okoljskim dejavnikom;
- sorodniki v družini, ki trpijo zaradi onkoloških, duševnih, žilnih in endokrinih bolezni.
Kako je molekularni genetski test
Prva faza molekularno genetske analize je zelo pomembna in je sestavljena iz pridobivanja vzorcev RNA in DNA, ki so posamezni fragmenti celične DNA ali njene celotne verige. Za izolacijo zahtevanega števila fragmentov se uporabi metoda pomnoževanja, tj. Njihova reprodukcija s polimerazno verižno reakcijo (encimska replikacija)..
Analiza molekul DNK zahteva njihovo predhodno delitev na dele in zdravljenje z bakterijskimi endonukleazami (restrikcijami) - encimi, ki lahko razrežejo dvojno vijačnico DNK v 4-6 parov..
DNA fragmenti so razdeljeni po dolžini in velikosti s posebnim gelom (poliakrilamidom in agarozo) z uporabo elektroforeze. Pod delovanjem slednjega se premikajo po gelu z različno hitrostjo, pri čemer za njimi ostane diskretni trak..
Molekularne genetske študije o dednih patologijah se uporabljajo tudi za preučevanje človeškega genoma. Southern hibridizacija omogoča, da v tem primeru določimo specifične fragmente DNA, ki so potrebni za to. Istočasno se najprej zatečejo k denaturaciji DNK, zaradi česar so fragmenti pridobljeni v obliki ene verige in preneseni v filter (najlon ali nitroceluloza), ki je namočen v puferski raztopini..
Gel, na katerem se nahajajo fragmenti DNA, prenesemo na filtrirni papir s slano raztopino (z visoko koncentracijo%). Nitrocelulozni filter in filtriranje, vendar suh papir (za absorpcijo slane raztopine), se nato postavijo na vrh. Posledica tega je, da enoverižna DNA ostane na filtru v istem položaju kot na gelu..
Za identifikacijo potrebnih fragmentov izvedemo postopek hibridizacije DNA s kloniranim fragmentom ali radioaktivno DNA sondo. Rezultat tega postopka se odkrije z radioautografijo, zaradi katere se vse komplementarne sonde zaporedja DNA odbijejo v obliki radioaktivnega pasu..
Južna metoda omogoča, da se ponovno ustvari omejevalni zemljevid človeškega genoma v določenem delu gena. To omogoča odkrivanje prisotnosti morebitnih okvar v samem genu. Razvite metode so zelo učinkovite in omogočajo najbolj natančno diagnozo dednih bolezni. V ta namen se DNA pridobiva iz zarodnih celic, ki jih vsebuje amnijska tekočina. Nato se hibridizira z uporabo Southern blot z radioaktivno DNA sondo. Zato je zelo enostavno prepoznati nenormalen embion, ker se njegova DNA hibridizira izključno z DNA sondo, ki je komplementarna mutantnemu zaporedju..
Sodobna znanost uporablja številne metode za identifikacijo mutacij. Vsi so razdeljeni na posredne in neposredne metode molekularnih genetskih raziskav..
Posredne metode odkrivanja mutacij so uporabljene, če je pozicija gena na genetski karti znana, vendar njena nukleotidna sekvenca ni dešifrirana..
Neposredna diagnoza je lahko več vrst:
- Zaporedje. To je tehnika za identifikacijo nukleotidnega zaporedja za določitev zamenjave baz v določenem fragmentu..
- Blotna hibridizacija, toda južna. To je omejevalna analiza, s pomočjo katere najdejo mutacije, ki imajo kršitve mesta restimacije..
- Alelospecifična hibridizacija s sintetično sondo. Ta metoda omogoča tudi odkrivanje mutacij v genomski DNA..
- Elektroforeza dvoverižne DNA v gelu (enakomerno denaturiranje, nevtralno). To je cepitev DNK na kemični in encimski ravni. Na tistih mestih, kjer so baze nepravilno šivene, je običajno definirana skupina mutacij..
- Študija elektroforetske mobilnosti molekul DNA mutantov.
- Analiza sintetiziranega proteina z elektroforezo. Prisotnost mutacij je ocenjena s spremembo mobilnosti beljakovin v sistemu in vitro.
Mutacije diagnosticiramo tudi z definicijo polimorfnih fragmentov (omejevalna dolžina) v genomu. Za ta namen se uporablja ista tehnika hibridizacije po Southern blot..
Med drugimi vrstami polimorfizma DNA se razlikujejo tudi mikrosateliti. To so kratke sekvence DNA (tandemsko ponavljajoče se mono-, di-, tri- in tetranukleotid). Služijo kot markerji defektnih mutacij ali markerskih lokusov alelnih variant gena v študiji..
Gen, ki je odgovoren za razvoj Huntingtonove koreje, hude patologije, je bil odkrit leta 1993. S to boleznijo se zmanjšuje intelektualni razvoj, motnja gibanja CNS pri ljudeh po 40 letih. Bolezen je dedna in se prenaša z avtosomno dominantnim tipom, ima 100% penetracijo. Gen bolezni se nahaja v 4. kromosomu, v kratki roki.
Ta gen vključuje nukleotidno zaporedje v obliki večkratnih ponovitev CAG nukleotida. Pri zdravih ljudeh so taka ponavljanja običajno 11-34, bolniki s horejo imajo 37-86, vendar ponavadi 45. Iz tega sledi, da je Huntingtonova horeja dedna patologija z mutacijo genov v večkratnem povečanju števila njenih kopij (ekspanzija)..
Julia Viktorova, porodničar-ginekolog